水处理生物学实验指导书

实验须知

1. 每次实验要进行充分预习,做到心中有数。

2. 认真做好实验记录,小心使用各种仪器、器皿。

3. 保持室内清洁,注意操作安全。

4. 实验完毕要洗净收拾好所用各种物品放回原处,如有损坏应及时报告教师。

5. 实验室中各种菌种和物品不得私自携出室外。

实验项目

一 显微镜的使用及微生物形态的观察

二 微生物形态的观察

三 培养基的制备与灭菌

四 微生物的纯种分离、培养与接种

五细菌的计数

六微生物的染色

七大肠菌群的测定

实验一 显微镜的使用及微生物形态的观察

一、目的:

1.学习掌握普通光学显微镜及测微尺的使用方法。

2.了解活性污泥中的微生物种类和微生物的基本形态。

二、实验器材

1.生物显微镜、目测微尺、镜测微尺、载玻片、盖玻片等。

2.活性污泥。

三、内容和步骤

1.观察前的准备

(1)了解显微镜的构造和使用方法,将显微镜置于平稳的实验台上,坐的姿势要端正,两眼同时睁开,一般用左眼观察,右眼记录或绘图。

(2)调节光源,在对光时,要使全视野内为均匀的明亮度,观看染色标本时,光线应强,观察未染色标本时,光线不宜太强。

2.低倍镜观察,观察标本时须先用低倍镜观察,因为低倍镜视野较大,较容易发现目标,将观察标本处于接物镜正下方,使接物镜降至距标本约0.5厘米处,然后用粗调节器慢慢升起镜筒。至物像出现后再用细凋节器调节到物像清楚为止,然后移动标本,将主要标本部位移到视野中心,用高倍镜继续观察。

3.高倍镜观察

用高倍镜观察时应先调节好光圈,使光线呈适宜的明亮度,用低倍镜的同样方法,调节出清楚物像,找到理想的部位,移至视野中心观察。

4.用低倍镜及高倍镜观察活性污泥中的微生物。

5.利用物测微尺对目测微尺进行标定,测定某一微生物的大小。

四、实验结果

认真绘制观察到的活性污泥中各种微生物的形态、特点;选择一种微生物,记录其大小。

实验二 微生物形态的观察

一、目的:

1.进一步掌握普通光学显微镜的使用方法。

2.观察微生物的基本形态。

二、实验器材

生物显微镜、微生物标本、镜油、擦镜纸等。

三、内容和步骤

1.复习显微镜低倍镜、高倍镜的使用方法。

2.油镜观察

使用油镜对染色细菌进行观察。在观察前先用高倍镜检查将标本移到中央,然后换成油镜,在油镜下方标本玻镜片上滴一滴镜油,从侧方注视,使镜头尖端和油镜接触,注意不要压在玻片上,然后从接目镜观察,用细调节器调至标本清晰。切记不要用粗调节器。油镜用完后,必须用擦镜纸将油镜头和标本玻片所粘着的油拭净,必要时要用二甲苯擦拭镜头。

3. 用油镜观察各种细菌标本。

四、实验结果

认真绘制观察到的各种微生物标本的形态、特点。

实验三 培养基的制备与灭菌

一、目的:

1.掌握培养基的配制方法;

2.学习高压灭菌消毒的方法。

二、实验器材

1.药品(牛肉膏、蛋白胨等);

2.玻璃用品(烧杯、试管、三角瓶等);

3.天平;

4.电炉等。

三、内容步骤

1.普通培养基配制

(1)药品成份

牛肉膏 0.65g 蛋白胨 2.0g 氯化钠 1.0g 琼 脂 3.5g 蒸馏水 200ml

(2)制备方法

准备一只小烧杯和一支小玻棒,称重后按定量要求称取牛肉膏,然后按定量蒸馏水冲洗到一大烧杯中。接着再将其余成份按定量称取,放入同一大烧杯中,加热使其溶化。加热中应不断搅拌以免溢出和烧焦。待其完全溶化后,调整溶液的pH值为7.4~7.6,补足因蒸发而减少的水量。然后将调好的溶液趁热装入250ml的三角瓶中,瓶口用棉塞塞住,并用报纸、小绳捆扎好瓶口,最后放入高压无菌器中,以121℃(15磅/英寸2)灭菌20分钟。

2.远腾(品红亚硫酸钠)培养基配制方法

(1) 药品成份

牛肉膏 0.65g 蛋白胨 2.0g 乳糖 2.0g 磷酸氢二钾 0.65g

琼 脂 5.0g 蒸馏水 200ml

(2) 制备方法

先称取牛肉膏(方法同普通培养基),然后用150ml蒸馏水将其冲洗到一烧杯中,再将琼脂加入蒸馏水中,加热溶解,接着加入磷酸氢二钾及蛋白胨,调匀溶解,补足200ml蒸4,最后加入 乳糖,混 匀溶解,装入三角瓶,用棉塞塞住并用报纸和小绳捆好,置灭菌器中115℃(10磅/英寸2 )消毒20分钟。

3.无菌水制备(后续实验用)

(1)取5支试管,每管加入10ml自来水,每支均用棉塞塞住管口。

(2)另取3支空试管同样用棉塞塞住管口,然后将8支试管口向上,用报纸、小绳捆好,置高压灭菌器中灭菌。

(3)准备3支lml移液管及1支5ml移液管用报纸卷好捆在一起灭菌,下次实验备用。

实验四 微生物的纯种分离、培养与接种

一、目的:

1.掌握微生物纯种分离及培养方法

二、器材

无菌培养皿、吸管、试管、接种环、酒精灯等

三、内容和步骤

1 实验样品制备:取经过破碎和过滤,处理的活性污泥于三角瓶中(已备)。

2 水样稀释:取上次实验制备的3支装有9ml无菌水的试管分别以10-1、10-2、10-3,依次编号。在无菌操作下,用1ml无菌吸管吸取1ml活性污泥样品于第一支试管中并吸洗3次混匀,再从第一管中吸取1ml菌液于第二支试管中吸洗3次混匀,以此方法依次稀释至第3支试管。

3 平板的制做:取无菌培养皿4个编成两组(每组2个),编号为10-2、10-3,另取一支无菌吸管,从浓度小的10-3开始,依次从10-3、10-2两个试管中分别吸取0.2ml菌液于相应的培养皿内(每个浓度2个)。然后,无菌操作下取40~50℃左右的已灭菌的普通培养基倒入上述培养皿内,倒入的培养基不得超过培养皿的1/3高度(约15ml),加盖在桌上轻微转动,以便菌液与培养基混和均匀,然后静置,待其冷却凝固,放入培养箱中,30℃培养24小时。

4 细菌的间接计数

将培养的活性污泥稀释菌液进行观察比较,记数一个稀释倍数的培养皿内的菌落数(最好选取平板上为50个左右的菌数,取2个平皿的平均数)。

计算:

活性污泥活菌数/毫升=平皿内菌落×5×稀释倍数。

5 菌落观察

观察活性污泥中优势菌落:选取培养皿内相同菌落(颜色、形态、大小)较多的菌落为优势菌落,描述其特征

四、实验结果

计算每毫升活性污泥中的活菌数;描述活性污泥中优势菌落的特征。

实验五 细菌的计数

一、目的:

学习掌握微生物的计数方法

二、器材

显微镜、血球计数器等

三、内容和步骤

1.血球数器:一块刻有网格(计算室)的特制载玻片。

放大后的方格网 放大后的计算室

2.微生物的直接计数方法

(l)将实验四中10-3稀释液的试管内加结晶紫2~3滴,混匀静置5分钟,然后用无菌吸管吸一滴于血球计数器上。

(2)将血球计数器加盖玻片于显微镜下观察,先用低倍镜找到计数室(有双线),然后换成高倍镜或油镜找到计数室的中格和小格,进行细菌计数。

(3)计数大方格中四个角的中方格及中央的一个中方格内的细菌数,每个中方格内计数四个小方袼的细菌数,共计20个小方格的细菌数。

四、实验结果

将计数结果填于下表,并计算1毫升菌液中的细菌总数。

计算次数各中格中菌数总数M 1毫升菌液中总菌数= M/5×25×10×1000×N(稀释倍数)二次平均数
12345
笫一次
第二次

实验六 微生物的染色

一、目的:

1.学习微生物涂片、染色的基本技术,掌握单染色及革兰氏染色的方法

2.进一步熟悉显微镜的使用。

二、实验器材

显微镜、洒精灯、接种环、染色液等

三、内容和步骤

(一)单染色的操作步骤

1.涂片:在干净的载玻片中央滴一滴生理盐水,用接种环取少量菌体接至玻片水滴中,和匀后涂成薄片,所取菌体不宜过多。

2.干燥:可在空气中自然干燥,也可在酒精灯上方稍稍加热进行干燥,使菌体位置不再流动。

3.固定:继续在酒精灯火焰上方移动3次,使菌体细胞质凝固定细胞形态,使其不易脱落便于染色。

4.染色:放标本于水平位置,在上面滴加染液。染色时间长短随不同染液而定(美蓝约染3-5分钟,石碳酸品红约1-2分钟)。

5.水洗

6.干燥

(二)革兰氏染色的操作步骤

1.涂片:在干净的载玻片中央滴一滴生理盐水,用接种环取少量菌体接至玻片水滴中,和匀后涂成薄片,所取菌体不宜过多。

2.干燥:可在空气中自然干燥,也可在酒精灯上方稍稍加热进行干燥,使菌体位置不再流动。

3.固定:继续在酒精灯火焰上方移动3次,使菌体细胞质凝固定细胞形态,使其不易脱落便于染色。

4. 染色

(1)初染:加草酸铵结晶紫一滴,约一分钟,水洗;

(2)媒染:加碘液,一分钟后水洗。

(3)脱色:将载片上水甩净,将酒精滴至涂片上,轻微晃动,约30--40秒钟立即用水清洗。要严格掌握酒精脱色程度,如脱色时,阴性菌易被误染为阳性菌,而脱色过度则阳性菌可被误染为阴性菌。

〈4〉复染:滴加沙黄1--2滴,一分钟后水洗。

(5)镜检:水洗干燥后,置油镜下观察,革兰氏阴性菌呈红色、革兰氏阳性菌呈蓝紫色,观察时应选分散开的菌体,过于密集的菌体不易观察,同时,密集的菌体常呈假阳性。

四、实验结果

绘制单染色和革兰氏染色观察到的细菌形态,革兰氏染色需注明染色反应。

实验七 水中大肠菌群的测定

一、目的:

1.掌握大肠杆菌在特殊培养基上菌落特点及革兰氏染色法

2.了解生化实验方法及操作技术

二、实验器材

抽滤装置、真空泵、显微镜、洒精灯、接种环、染色液等

三、内容和步骤

1.远腾培养基的平板制备

药品: 无水亚硫酸钠 1.0g 5%碱性品红乙醇溶液 4ml

(1)将所制远腾培养基加热融化,同时称取1.0克无水亚硫酸钠,置于无菌试管1中,加入5~6ml无菌水,使其溶解,再置沸水浴中煮沸腾10分钟灭菌。

(2)用无菌吸管吸取4ml碱性品红乙醇溶液,置于无菌试管2中。

(3)待试管1冷却后,直接倒入试管2中,边倒边摇,直至碱性品红溶液至深红色褪成淡粉红色为止。

(4)将此混合液全部加入已灭菌的上面所制远腾培养基内,并混合均匀(不要产生气泡)。

(5)将所制培养基倒入培养皿中(不超过1/3高度),备用。

2.滤膜法测大肠菌群

(1)抽滤及培养

A 用无菌滤膜置于无菌的滤器支板上,夹好固定,将所测水样慢慢注入,同时,打开抽滤机进行抽滤(每组2个)。将滤后的滤膜取下把无菌面贴放在远腾培养基上(紧密贴放,不要有缝隙)。

B 培养皿加盖后倒置于培养箱内30℃培养24小时。

(2)平板分离

A 大肠杆菌菌落的观察:根据大肠杆菌在远腾培养基上形成的菌落形态、颜色等特点初步确定可能是大肠杆菌菌落。

B 将确定的可疑菌落进行涂片,革兰氏染色油镜观察其形态和染色反应进行初步鉴定并做图记录。

(3)大肠杆菌的生物化学实验

A 取葡萄糖、乳搪、蔗糖、麦芽糖、山梨醇等微量发醇管各一支,用砂轮在无液端1/3处锯断。

B 在无菌操作下,用接种针,挑取初步鉴定的大肠菌落的菌块接种于上述各发酵管内,然后平放在空培养皿内,置培养箱内37℃培养24小时。

C 将培养后的发酵管进行观察,如发现发酵管内培养液由紫变成淡黄色为反应阳性(+),否则为阴性(-),如管内同时有气体产生为阳性(+)。

3.发酵法测大肠菌群

(1)初步发酵

A 在3支装有己灭菌的9ml浓乳糖蛋白胨培养基的小发酵管(内有倒管)中,以无菌操作各加入水样1ml,混匀。

B 混匀后置于37℃恒温箱中培养24h。

C 观察培养后的小发酵管中产气产酸的情况。

a.如无气体和酸产生,则为阴性反应,表示无大肠菌群存在。

b.如有气体和酸产生,或虽无气体产生,但有酸形成,则为阳性反应,表示可能有大肠菌群存在,需进一步检验。

c.如有气体形成,但没有产酸,溶液也不浑浊,则操作技术上有问题,须重作检验。

(2)平板分离

用无菌接种环,从前一阶段所需进一步检验的发酵管中沾取菌液,在远腾培养基上划线,然后将培养皿倒置于37℃恒温培养箱中培养24h,记录结果如下:

a.如无细菌增殖现象,可认为是阴性反应,无大肠菌群存在。

b.如仅发现芒状、霉状或其它无关菌属的菌落,则表示无大肠菌群。

c.如发现菌落有下列特征:紫红色,具有金属光泽;深红色,不带或略带金属光泽;淡红,中心色较深,则应取菌落的一小部分进行涂片,革兰氏染色,镜检。如涂片中没有革兰氏阴性的杆菌,则表示无大肠菌群存在;如涂片中有革兰氏阴性无芽孢的杆菌时,则应按步骤2进行复发酵实验。

(3) 复发酵

(1)取葡萄糖、乳搪、蔗糖、麦芽糖、山梨醇等微量发醇管各一支,用砂轮在无液端 1/3处锯断。

(2)在无菌操作下,用接种针,挑取初步鉴定的大肠菌落的菌块接种于上述各发酵管内,然后平放在空培养皿内,置培养箱内37℃培养24小时。

(3)将培养后的发酵管进行观察,如发现发酵管内培养液由紫变成淡黄色为反应阳性(+),否则为阴性(-),如管内同时有气体产生为阳性(+)。

四、实验结果

记录分析每一步的结果,并给出最终结论。

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Source: github.com/k4yt3x/flowerhd
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